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熒光-PCR法的主要理論依據(jù)說明

更新時間:2021-04-08點擊次數(shù):1176
   熒光-PCR法是通過熒光染料或熒光標(biāo)記的特異性探針,對PCR產(chǎn)物進行標(biāo)記跟蹤,實時在線監(jiān)控反應(yīng)過程。PCR擴增時加入一對引物和一個特異性的熒光探針,該探針為一寡核苷酸,兩端分別標(biāo)記一個報告熒光基團和一個淬滅熒光基團。探針完整時,淬滅基團抑制報告基團的熒光發(fā)射。剛開始時,探針結(jié)合在DNA任意一條單鏈上,PCR擴增時,Taq酶的5’端-3’端外切酶活性將探針酶切降解,報告基團與淬滅基團發(fā)生分離,抑制作用被解除,從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號。隨著PCR反應(yīng)的進行,反應(yīng)產(chǎn)物不斷累積,熒光信號強度也等比例增加。每經(jīng)過一個循環(huán),收集一次熒光強度信號,這樣就可以通過熒光強度變化監(jiān)測產(chǎn)物量的變化,結(jié)合相應(yīng)的軟件對產(chǎn)物進行分析進而得到一條熒光擴增曲線。熒光擴增曲線分熒光背景信號階段、熒光信號指數(shù)擴增階段和平臺期三個階段。指數(shù)期的PCR產(chǎn)物量的對數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系,因此我們選擇在這個階段進行定量分析,計算出待測樣品初始模版的量。
  熒光-PCR法的理論依據(jù)是什么?
  特定的待擴增基因片段起始含量越大,則指數(shù)擴增過程越短,當(dāng)擴增速率趨于穩(wěn)定后,則無論原來樣品中起始模板含量多少,終擴增片段的含量通常是一樣的。理想的擴增結(jié)果:Y=X×2n;其中:Y代表擴增產(chǎn)物量,X代表PCR反應(yīng)體中的原始模板數(shù),n為擴增次數(shù);理論上PCR擴增效率為100,PCR產(chǎn)物隨著循環(huán)的進行成指數(shù)增長,但實際上DNA的每一次復(fù)制都不*,即每一次擴增中,模板不是呈2的倍增長;實際應(yīng)為:Y=X(1+E)n,其中:E代表擴增效率,E=參與復(fù)制的模板/總模板,通常E≤1,E在整個PCR擴增過程中不是固定不變的。通常X在1-105拷貝、循環(huán)次數(shù)n≤30時,E相對穩(wěn)定,原始模板以相對固定的指數(shù)形式增加,適合定量分析,這也就是所謂的指數(shù)期;隨著循環(huán)次數(shù)n的增加(>30次),E值逐漸減少,Y呈非固定的指數(shù)形式增加,后進入平臺期。

TEL:021-61210612

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